Créer des images photon par photon pour hausser le contenu informatif des microscopes

Les détecteurs à matrice rapides et compacts ouvrent de nouvelles perspectives dans le domaine de la microscopie à balayage laser. Ces dispositifs, qui remplacent les détecteurs à élément unique des microscopes con-focaux traditionnels, offrent des capacités inédites et prometteuses.

Contrairement aux détecteurs conventionnels qui ne fournissent que la valeur d’intensité de la lumière collectée, un détecteur à matrice permet également d’enregistrer la distribution spatiale de la lumière incidente. Il construit ainsi une petite image de la zone éclairée pour chaque point de balayage.

Les informations spatiales supplémentaires fournies par les détecteurs à matrice permettent une technique de super-résolution connue sous le nom de microscopie à balayage d’image (ISM). L’ISM construit informatiquement une seule image à partir d’un ensemble de données multidimensionnelles brutes produites par un microscope. L’image finale est construite avec un meilleur rapport signal/bruit (SNR), une section optique et une résolution spatiale supérieure à celle d’un microscope con-focal traditionnel.

Un microscope ISM compact récemment mis au point, équipé d’un détecteur à matrice de diodes à avalanche à photon unique (SPAD), permet d’obtenir une imagerie structurelle et fonctionnelle à haute résolution. Crédit : A. Zunino (IIT).

Une avancée majeure : le microscope ISM compact

Récemment, des chercheurs de l’Institut italien de technologie (IIT) à Gênes ont développé un microscope ISM compact et efficace équipé d’un détecteur à matrice de diodes à avalanche à photon unique (SPAD) capable de fournir des images structurales et fonctionnelles de haute résolution dans une seule architecture.

Le détecteur à matrice SPAD rapporté se compose de 25 diodes indépendantes disposées en grille carrée. La petite taille et la lecture asynchrone permettent une détection rapide des photons de fluorescence incidente. Le schéma d’acquisition des données, basé sur la méthode du domaine de fréquence numérique (DFD), est une technique d’échantillonnage hétérodyne qui permet la construction de l’histogramme de déclin de fluorescence avec une résolution temporelle jusqu’à 400 ps, adaptée à la plupart des applications d’imagerie de fluorescence.

(a) Comparaison des cartes de durée de vie de fluorescence confocale et ISM des filaments de tubuline d’une cellule HeLa. (b) Comparaison de l’image STED brute et de l’image ISM-SPLIT-STED des filaments de tubuline. (c) Représentation du phasage de deux colorants ayant le même temps de vie et des spectres d’excitation qui se chevauchent, excités individuellement par deux impulsions laser différentes (en haut). Représentation en phase des contributions mixtes des deux colorants (en bas). (d) Séparation des canaux à l’aide du time gating (à gauche) et de la séparation des phasers (à droite). En raison de la diaphonie, seule la séparation de phase permet de distinguer les deux colorants. Crédit image : Tortarolo, Zunino, et al

En synthèse

Grâce aux informations spatiales et temporelles uniques fournies par le détecteur à matrice SPAD, les auteurs ont démontré la combinaison de mesures de durée de vie de fluorescence (FL) avec l’ISM (FLISM). En plus des avantages conventionnels de l’ISM, le SNR amélioré des images FLISM permet une estimation plus robuste de la durée de vie de fluorescence.

Le système peut distinguer différents colorants avec leurs valeurs de durée de vie de fluorescence, grâce à la représentation phasor de la dynamique de fluorescence. Même en utilisant des colorants avec des valeurs de durée de vie similaires et des spectres d’excitation se chevauchant, il peut distinguer les différents fluorophores en utilisant la technique d’excitation à impulsions alternées.

Pour une meilleure compréhension

Qu’est-ce qu’un détecteur à matrice ?

Un détecteur à matrice est un dispositif qui permet d’enregistrer la distribution spatiale de la lumière incidente, construisant ainsi une petite image de la zone éclairée pour chaque point de balayage.

Qu’est-ce que la microscopie à balayage d’image (ISM) ?

L’ISM est une technique de super-résolution qui construit informatiquement une seule image à partir d’un ensemble de données multidimensionnelles brutes produites par un microscope.

Qu’est-ce que le détecteur à matrice SPAD ?

Le détecteur à matrice SPAD est un dispositif composé de 25 diodes indépendantes disposées en grille carrée. Il permet une détection rapide des photons de fluorescence incidente.

Qu’est-ce que la durée de vie de fluorescence (FL) ?

La durée de vie de fluorescence est le temps moyen qu’un fluorophore excité passe à l’état excité avant de revenir à l’état fondamental.

Qu’est-ce que la technique d’excitation à impulsions alternées ?

La technique d’excitation à impulsions alternées est une méthode qui permet de distinguer différents fluorophores, même lorsqu’ils ont des valeurs de durée de vie similaires et des spectres d’excitation se chevauchant.